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微生物分子育种技术

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-10-22  浏览次数:707
 ⒈ 链霉菌的基因克隆

链霉菌基因克隆的基本步骤如下:
⑴ 制备供体DNA 对供体菌进行适当培养后,分离染色体DNAim体育登录im体育登录,用限制性内切酶将染色体DNA切成大小不等的DNA片段im体育登录。
⑵ 制备载体DNA 载体是链霉菌质?im体育登录;蚴删?im体育登录,往往是经过高度修饰的im体育登录im体育登录、能提供多种优良性状的环状DNAim体育登录im体育登录im体育登录im体育登录。它通常具备有复制起始点(提供自主复制能力)和遗传标记(常为抗生素耐药基因)im体育登录。遗传标记基因有两种类型,当被克隆的供体DNA片段和载体连接时im体育登录,一种遗传标记基因不会失活im体育登录,便于将来筛选转化子im体育登录。另一种遗传标记基因中含有限制性内切酶位点im体育登录im体育登录,供体DNA片段插入该位置可使该基因功能丧失im体育登录。分离载体DNA(质粒)时,为了挑选含有质粒的细胞,培养基中应含有适当量的药物im体育登录im体育登录,分离到的载体DNA用限制性内切酶消化im体育登录im体育登录,使载体DNA产生与供体DNA片段末端相匹配的黏性末端im体育登录im体育登录。再用磷酸化酶脱磷,以防止没有插入DNA时载体重新环化。
⑶ 连接载体和供体DNA片段 在连接酶作用下im体育登录,利用限制性内切酶所切出的黏性末端来连接载体和供体DNAim体育登录。
⑷ 将受体菌制成原生质体 选择受体菌株应考虑受体菌表型im体育登录、转化效率im体育登录im体育登录im体育登录、限制性内切酶活性和DNA酶活性im体育登录。受体菌株必须缺乏一种酶活力im体育登录,当基因克隆到载体并转入受体菌时im体育登录,可由该基因的产物来补充这种酶活性im体育登录im体育登录。例如克隆一种耐药基因,就要求受体菌株对那种药物敏感im体育登录im体育登录;克隆一种氨基酸生物合成有关的基因im体育登录im体育登录,就要求受体菌株是该种氨基酸的营养缺陷型im体育登录im体育登录。受体菌的转化效率受自身的转化能力im体育登录、载体im体育登录im体育登录、已经转化的原生质体的再生能力等因素的影响im体育登录im体育登录。受体菌的限制性内切酶活性能限制来自供体的插入DNAim体育登录,因此需设法降低该酶的活性im体育登录im体育登录,解决此矛盾主要有如下三种方法:① 挑选限制性内切酶活性低的菌株为受体菌im体育登录;② 对受体菌诱变im体育登录im体育登录im体育登录,降低限制性内切酶活力im体育登录;③ 对原生质体进行热处理,以降低限制性内切酶活力。许多菌株具有不耐热的限制性内切酶im体育登录,原生质体在45~50 ℃培养10~15 min,使其限制性内切酶变性im体育登录,但原生质体存活im体育登录,且能进行转化。一些链霉菌具有使DNA降解的DNA酶im体育登录,它由原生质体往外渗漏im体育登录,或是存在于某些原生质体溶解后的溶液中im体育登录im体育登录。因此im体育登录,如果质粒DNA加到原生质中时im体育登录im体育登录,将有部分DNA降解,而使得转化效率降低??捎萌却砘蛟诩尤胫柿NA之前先在原生质体中加入异源DNA(如小牛胸腺DNA)im体育登录,以减少DNA酶对质粒DNA的降解im体育登录im体育登录。
受体菌的原生质体制备一般需将细胞在含有0.5%的甘氨酸的培养基中培养,使菌丝体对溶菌酶的处理更加敏感im体育登录im体育登录im体育登录。
⑸ 转化作用 用PEG将DNA导入原生质体中。
⑹ 再生和选择 在转化之后im体育登录,要有一定时间让编码耐药酶的基因进行表达,同时在细胞内形成足够量的耐药酶以显示耐药表型。因此im体育登录,假如被转化的原生质体直接涂在含有药物的培养基上,它们将会被杀死im体育登录。相反im体育登录,当它们被涂在不含有药物的再生培养基上im体育登录,与未被转化的原生质体一起进行一段时间的非选择性再生im体育登录im体育登录im体育登录。此后im体育登录,加药物到再生培养基上,那么没有被转化的原生质体被杀死im体育登录,而转化体存活下来了im体育登录。

⒉ 链霉菌抗生素生物合成基因的克隆

  典型的抗生素并非单一基因的产物im体育登录,因此只有把所有与该抗生素生物合成有关的结构基因克隆到适宜的宿主中去才能得到一个理想的克隆体im体育登录im体育登录。如果所用的宿主对这个抗生素是敏感的im体育登录,还需将抗性基因一起转入宿主im体育登录im体育登录。幸运的是合成某种抗生素所需的全套基因im体育登录im体育登录im体育登录,甚至包括抗性基因往往排列成簇,这就使得分离抗生素生物合成基因比原来想象的要容易一些。在克隆抗生素生物合成基因方面前人已总结出如下七个克隆策略im体育登录im体育登录。
⑴ 检测克隆到标准宿主中的个别基因产物im体育登录im体育登录;
⑵ 利用产生菌阻断突变株的互补作用im体育登录;
⑶ 利用突变克隆技术;
⑷ 连锁的抗生素抗性基因的克耰m体育登录?;
⑸ 用人工合成的寡核苷酸探测基因文库(gene library)im体育登录;
⑹ 直接克隆抗生素产生菌DNA大片段到非产生菌中;
⑺ 用一种抗生素的克隆DNA去探测相关抗生素的同源基因im体育登录im体育登录。

⒊ 利用基因工程技术生产新的抗生素

将一种抗生素生物合成基因引入产生结构相近似的抗生素产生菌im体育登录,可改造抗生素的结构。如将放线紫红素全部生物合成基因转入曼得霉素或榴霉素产生菌im体育登录,得到曼得紫红素或二氢榴红霉素。外源基因的作用可分为两种情况im体育登录。第一种情况是,外源基因转入后im体育登录,使原来不具备羟化酶基因的曼得霉素产生菌获得了来自放线紫红素产生菌的羟化酶基因。由于放线紫红素和曼得霉素的结构相似im体育登录,放线紫红素产生菌的羟化酶基因产物im体育登录,可使曼得霉素羟基化im体育登录im体育登录im体育登录im体育登录。第二种情况是放线紫红素的生物合成基因产物,利用了原来存在于榴霉素产生菌中能合成放线紫红素部分结构的前体物质im体育登录,与榴霉素生物合成酶共同起作用im体育登录,合成了兼有二者结构的二氢榴红霉素im体育登录im体育登录。
随着基因工程育种技术的发展im体育登录,目前已可能将供体菌的个别基因从一整套的生物合成基因中转移给别的链霉菌im体育登录,或者将其完整的生物合成基因转移到别的链霉菌进行重组im体育登录im体育登录im体育登录,并得到表达im体育登录im体育登录。这样,人们有可能运用基因工程育种技术人为地剔除某个有害的基因或引进某个需要的基因去改造已有的抗生素结构im体育登录。例如im体育登录,将布替罗星的侧链的生物合成基因引入卡那霉素产生菌并得到表达,就可以不经过化学方法的结构改造直接生物合成丁胺卡那霉素im体育登录。

⒋ 利用基因工程技术生产氨基酸

氨基酸生产菌的基因克隆系统多采用“鸟枪”法,即利用一种或几种限制性内切酶将某一菌株的DNA分子切割成相当于一个或者大于一个基因的片段im体育登录,然后将这些片段一一与载体连接im体育登录,制成重组DNA分子im体育登录im体育登录,转化到另一菌株中进行体内无性繁殖im体育登录im体育登录,最后对所有带有重组DNA分子的细菌(组成基因文库)进行培养和选择im体育登录,从中挑出含有目的基因的转化子im体育登录im体育登录。
利用基因工程技术将氨基酸合成酶基因克隆是提高氨基酸产量的有效途径im体育登录。目前,几乎所有的氨基酸合成酶基因都可以在不同系统中克隆与表达im体育登录。其中苏氨酸、色氨酸im体育登录、脯氨酸和组氨酸等的工程菌已达到工业化生产水平im体育登录。例如在L-色氨酸生产中,利用色氨酸合成酶基因和丝氨酸转羟甲基酶(催化甘氨酸和甲醛合成丝氨酸的酶)基因的重组质粒im体育登录,在大肠杆菌中克隆化。通过添加甘氨酸来制造L-色氨酸im体育登录,该方法能使上述两种酶的活性提高而增产L-色氨酸im体育登录m体育登录;蚬こ逃旨际趸褂Ω煤推渌旨际跸嘟岷喜鸥行?。例如色氨酸的工程菌经过菌种筛选im体育登录im体育登录,工程菌的色氨酸产量由最初的6.2 g/L上升到50 g/Lim体育登录。
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