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饲料中有害微生物快速检测技术新进展

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-10-22  浏览次数:895
   当前,饲料安全问题已成为全球关注的重要议题,而有害微生物污染也成为饲料安全中的一项主要控制指标。饲料厂有害微生物主要有有害细菌im体育登录、霉菌、大肠菌群等im体育登录,它们对饲养动物和动物源性食品危害很大im体育登录。饲料生产企业在生产过程中普遍存在有害物质im体育登录,包括有害微生物的交叉污染。要控制饲料原料im体育登录im体育登录、产品中有害微生物im体育登录,首先必须要有能够准确快速的有害微生物捡测方法im体育登录im体育登录im体育登录im体育登录。经典的标准检测方法往往比较费时im体育登录im体育登录,所以有害微生物快速检测方法成为近年来的研究热点。本文根据近年来国内外已发表的研究文献,总结有害微生物快速检测方法的研究进展im体育登录im体育登录im体育登录im体育登录,供参考im体育登录。

1 饲料中有害微生物快速检测方法研究进展

1.1 生物传感器技术

生物传感器(biosensor)是指对生物物质敏感并能将其浓度转换为电信号进行检测的仪器;生物传感器又分为:酶生物传感器im体育登录、微生物传感器和免疫传感器im体育登录。它们具有成本低、体积小im体育登录、灵敏度较高的优点im体育登录im体育登录;能从腐败或者半腐败的食品im体育登录im体育登录、饲料中得到实时而快速im体育登录im体育登录、多样化的分析检测结果im体育登录im体育登录。

张杰等利用生物素——亲和素系统将分子马达与探针连接构建了F0F1——ATPase分子马达生物传感器,它能对副溶血性弧菌特异性识别,最低检测限为1pg/反应体系,对其致病性进行快速诊断,无需热循环反应,检测周期缩短im体育登录im体育登录im体育登录,整个分析过程只需1h——2him体育登录im体育登录,不需酶切及电泳等繁琐操作im体育登录im体育登录。

张捷等通过生物素——亲和素系统将特异性沙门氏菌特异性基因(invAim体育登录,作为其目的基因片段)核酸探针连接在F0F1——ATPase的ε亚基上构建生物传感器im体育登录;将待测样品和阴性对照分别与生物传感器结合后im体育登录im体育登录,比较其催化三磷酸腺苷(ATP)合成30min后的ATP产生量im体育登录,依此对样品中的沙门氏菌DNA进行检测im体育登录。该方法对沙门氏菌DNA的检测时间为1him体育登录im体育登录,检出限为10ng/mlim体育登录。从分析样本分离得到的30株细菌im体育登录,利用分子马达生物传感器的检测结果与PCR

检测的结果一致im体育登录。

Kim等为了提高传感器对单增李斯特菌的分析检测能力,设计了与实时的分析系统相连结的IMC??椋╥mmuno——magnetic concentration)im体育登录im体育登录im体育登录。生物传感器技术大大缩短了检测时间im体育登录im体育登录,可在数小时甚至数分钟内查出致病微生物im体育登录im体育登录im体育登录im体育登录,为微生物的快速检测提供了一种有效的工具im体育登录im体育登录im体育登录im体育登录。但该法在预处理方面受到某些限制im体育登录。

1.2 基因芯片技术

基因芯片技术是在生命科学领域迅速发展的新型食源性检测技术im体育登录im体育登录im体育登录。该法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合,大大提高了基因芯片的探针密度im体育登录im体育登录,且试剂用量减少im体育登录im体育登录,可以实现标准化和批量化大规模生产im体育登录,有很大的发展潜力im体育登录。将基因芯片技术与其它技术结合起来,能达到更好的效果im体育登录。

戈海泽等根据生物信息学技术以细菌16SrDNA和23SrDNA序列设计各细菌的特异型探针和引物im体育登录,在基因芯片制备基础上,通过对靶基因的扩增im体育登录、杂交和对杂交结果的分析im体育登录,对常见肠道致病菌的检测和鉴定效果进行评价im体育登录im体育登录im体育登录im体育登录,同时对临床采集100份腹泻患者粪便标本进行细菌培养im体育登录im体育登录。在100份临床粪便标本中im体育登录,采用基因芯片技术共检出50份(50%)携带肠道致病菌im体育登录;细菌培养鉴定出47份(47%)携带肠道致病菌im体育登录,其中42份基因芯片与细菌培养结果一致,准确率为79.25%,与细菌培养结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。该该法具有高通量im体育登录、高准确性和高灵敏度im体育登录,检测时间短im体育登录,可同时检测多种有害微生物im体育登录im体育登录,可以作为临床鉴定细菌的一个重要的方法im体育登录im体育登录。将广泛应用于食品饲料安全控制im体育登录im体育登录,突发性食品安全事件检测,出入境检验检疫等im体育登录,但检测费用昂贵。

1.3 聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段im体育登录,具有特异性强、灵敏度高im体育登录、简便快速和对标本的纯度要求低等优势im体育登录;不过检测样品较多时工作量大。在食品安全越来越严峻的形式下im体育登录,许多科技工作者试图多种检测方法联用im体育登录,达到解决上述问题的目的im体育登录im体育登录。将多种检测方法联用im体育登录,旨在弥补单一检测方法的局限性im体育登录im体育登录im体育登录。目前国际上研究的热点有多重荧光实时PCR检测技术im体育登录,兼具多重PCR和荧光实时PCR技术的实时定量检测监控PCR产物两方面的优点im体育登录。

石建玲等根据幽门螺杆菌23SrDNA序列设计引物和探针im体育登录,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR体系并进行方法学评价im体育登录im体育登录,对2012——05——10收集的100份临床样本进行检测并同时应用免疫组化及银染方法进行比较分析发现:检测范围宽,在107copies/l——102copies/l(指1l溶液里面DNA/RNA的拷贝数是多少个)内均呈现良好的线性关系im体育登录,且相关系数为1im体育登录im体育登录;与多种细菌均无交叉反应im体育登录,特异性好im体育登录;检测时间短im体育登录,整个PCR反应过程仅需70min;并可在不同拷贝数的标准品批内重复测定im体育登录im体育登录,对临床其它消化道病原体不出现特异性的扩增曲线im体育登录;实时荧光定量PCR具有灵敏度和特异性高及重复性好等优点。国外也有将酶联免疫吸附测定与PCR技术联用建立有害微生物检测方法的报道,有效的提高了有害微生物的检出率。

1.4 生物阻抗法

生物阻抗法的原理是利用由微生物新陈代谢引起的培养基电学特性变化快速检出样品中微生物的含量im体育登录。阻抗法具有能区分活细胞和死细胞的优势im体育登录im体育登录im体育登录im体育登录,而死细胞常常无致病性im体育登录,保障食品与饲料安全的关键就是检验活细胞的数量im体育登录。陈江利用阻抗法检测啤酒有害乳酸菌,630A培养基(奥地利SY——LAB公司)较适合于阻抗法,用E值作为阻抗值变化的判断标准,与传统培养基法检测结果相比im体育登录im体育登录,阻抗法的检测结果准确可靠im体育登录,能够将检测时间缩短至72h。此法检测速度很快im体育登录im体育登录,但只能确定污染程度im体育登录。

1.5 蛋白质芯片技术

蛋白质芯片技术又称蛋白质(微)阵列,是指将已知的大量蛋白质(如酶、抗原im体育登录、抗体、受体im体育登录、配体im体育登录、细胞因子等)固定在经化学修饰的固相载体(璃片、硅片等)上im体育登录,在保留蛋白质物化性质的基础上,蛋白质与载体表面结合im体育登录,再用激光扫描系统或者电感耦合器件获取相关图像;然后用专门的计算机软件分析图像、定性定量结果im体育登录。Howell等采用俗称软蚀刻的微接触印刷技术(microcontact printingim体育登录im体育登录,CP)制作出了一种可以检测大肠杆菌Eim体育登录。coli O157∶H7及鲑肾杆菌(renibacterium salmoninarum)的抗体微阵列im体育登录im体育登录,结果表明:此芯片与其他有害微生物的交叉反应少, 检出浓度为7×107cfu/mlim体育登录,检测时间是40minim体育登录,是一种很有效的微生物检测方法im体育登录im体育登录im体育登录。

方珍建立了检测E。coli O157∶H7的液相蛋白芯片方法。通过绘制检测曲线im体育登录,分别应用该方法及H2O作溶解剂的液相芯片方法检测实际牛肉样品im体育登录im体育登录。比较该方法与细菌分离培养法的阳性检出率im体育登录,能检出阳性的最低浓度为103cfu/ml(増菌后)im体育登录im体育登录,最低检出限为100cfu/ml;与18种肠道菌无交叉反应im体育登录im体育登录im体育登录,特异性良好;3次重复实验im体育登录im体育登录,批间变异系数7.61im体育登录im体育登录,重复性良好;应用该方法检测牛肉样品中人工添加细菌,能检出阳性的最低浓度为0.5cfu/ml(增菌前)im体育登录;应用该方法检测154份实际牛肉样品im体育登录im体育登录,检出阳性样品19份,而细菌培养法检出阳性样品16份。蛋白质芯片技术是一种高特异性im体育登录im体育登录im体育登录im体育登录、高灵敏度、高通量、重复性好im体育登录、应用性强im体育登录im体育登录im体育登录、适用范围广且微型化的分析技术im体育登录,在生命科学的各个研究领域有很好的发展前景im体育登录,但同基因芯片技术一样im体育登录im体育登录im体育登录,检测费用高im体育登录,发展还不成熟im体育登录。

1.6 纳米金标记技术

纳米金标记技术是指直径在1nm——100nm金的微小颗粒im体育登录,具有高电子密度im体育登录,介电特性和催化作用im体育登录,可以与多种生物大分子结合im体育登录im体育登录,且不影响生物大分子的生物活性im体育登录。近年来,基于纳米金标记的快速检测研究在有害微生物方面应用比较多im体育登录im体育登录,检测的微生物种类也比较多im体育登录im体育登录,国内外科技工作者通过对纳米金颗粒表面特性的处理以及在纳米金颗粒表面标记上特定的寡核苷酸探针im体育登录im体育登录,开发研究出了新的微生物检测系统。

刘霞利用氨基偶联法在传感器表面固定多克隆抗体(PAb)作为一抗im体育登录im体育登录,金纳米粒子(AuNPs)标记的大肠杆菌Eim体育登录im体育登录。coli O157∶H7的多克隆抗体(PAb)作为二抗im体育登录im体育登录im体育登录,通过三明治方法用双通道表面等离子体共振(SPR)传感器对Eim体育登录im体育登录im体育登录。coli O157∶H7进行检测im体育登录。SPR直接法检出限为103cfu/mlim体育登录im体育登录,线性范围为103cfu/ml——109cfu/mlim体育登录im体育登录;金纳米粒子增强三明治法的检出限为10cfu/mlim体育登录im体育登录im体育登录im体育登录,线性范围为10cfu/ml——1010cfu/mlim体育登录,灵敏度提高100倍im体育登录im体育登录,检测范围更宽im体育登录im体育登录,检测时间缩短,选择性和重现性较好im体育登录im体育登录。此技术具有简单、快速im体育登录、灵敏度高im体育登录、特异性强、价廉im体育登录、样品所需量少等优点im体育登录im体育登录,适合现场筛选im体育登录im体育登录,在饲料检测中有着广泛的应用价值和发展前景im体育登录im体育登录。

2 饲料中有害微生物快速检测设备

目前im体育登录im体育登录,生物学领域的专家通过对微生物快速检测方面深入的研究im体育登录,开发了一系列技术,有ATP荧光仪、多功能微生物荧光检测仪im体育登录、微生物实时光电检测系统im体育登录、纸片法im体育登录im体育登录。这些用于食品中有害微生物的快速检测技术im体育登录,未来同样可以在饲料中应用im体育登录,这些方法的应用将为饲料安全提供有力的保障,同时可以促进我国饲料工业的持续健康发展im体育登录。下面重点介绍常用的两种有害微生物快速检测设备im体育登录im体育登录。

2.1 RVLM 型微生物快速检测系统

由德国皇家生物科技公司生产的高性能便携式微生物检测仪将多种检验方法的优点集合应用im体育登录im体育登录im体育登录,如培养皿法、酶法(β——葡萄糖苷酸酶分析)im体育登录im体育登录、免疫法(抗原搜寻)im体育登录im体育登录、基因法(基因搜寻)im体育登录,具有便捷im体育登录im体育登录im体育登录、操作简单im体育登录im体育登录im体育登录、检验迅速im体育登录im体育登录、高灵敏性im体育登录、高特异性im体育登录、消耗成本低、定性半定量测量等诸多优点im体育登录。

2.1.1 快速检测对象

活菌总数im体育登录im体育登录、大肠菌群im体育登录、大肠杆菌、肠道杆菌科im体育登录、金黄色葡萄球菌im体育登录im体育登录、绿脓杆菌im体育登录、沙门氏菌、李斯特菌、肠球菌im体育登录、产气荚膜梭菌im体育登录im体育登录im体育登录、亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌im体育登录im体育登录、霉菌(曲霉属真菌、曲霉菌)im体育登录im体育登录、酵母菌im体育登录、军团菌等im体育登录im体育登录,可以定量检测im体育登录。

2.1.2 快速检测产品特点

应用范围广:应用于食品im体育登录、饲料im体育登录im体育登录、药品im体育登录im体育登录、水质im体育登录im体育登录im体育登录、空气微生物检测等众多领域im体育登录,可检测固态im体育登录、液态、气态及膏状im体育登录、浆状等多种样本im体育登录。

使用方便:一套便携系统即可完成采样、实验im体育登录、后处理等工作im体育登录,无需配备多种检测仪器im体育登录im体育登录。

操作简单:检测样本只需1ml或1gim体育登录im体育登录,且无需前处理im体育登录im体育登录im体育登录,只需3个步骤就可完成操作im体育登录。

高灵敏度:可检测到数量级为1cfu的目标微生物,满足国内国际微生物检测标准im体育登录im体育登录。

高特异性:特异性高达99.999%im体育登录,杜绝非目标微生物造成的实验干扰im体育登录im体育登录im体育登录。

准确度高:可100%定量分析im体育登录im体育登录im体育登录im体育登录。

检测数量:8个插槽可同时提供8项不同实验im体育登录im体育登录,13类不同标准培养环境。

快速检测:最快10min即可得到检测结果,可用于现场检测。

高智能化:能够自动控制孵育温度和孵育时间,并可自动生成实验报告im体育登录im体育登录。

全自动化:独立im体育登录im体育登录im体育登录、持续地检测并记录瓶中的微生物数量(cfu)im体育登录。

在欧洲的实验室中im体育登录,80%——90%的微生物检测实验采用的仪器是RVLM 型微生物检测系统im体育登录,其超高的灵敏度可以满足欧盟及国内检测标准im体育登录im体育登录im体育登录im体育登录。RVLM型微生物快速检测是目前业内最高端的智能优质微生物检测仪im体育登录im体育登录im体育登录。
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